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线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书
更新时间:2019-04-18
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所属分类:其他
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线粒体复合体Ⅱ试剂盒测定意义:
线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同时辅基FAD还原为FADH2,后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递链的支路。

线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书产品概述:

货号:YJ1347                                                   规格:100管/96样

线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同时辅基FAD还原为FADH2,后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递链的支路。

测定原理:

复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰,通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:液体 1.5mL×1 支,-20℃保存;

试剂四:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;

试剂六:液体 2.5mL×1 瓶,4℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆 600g,4℃离心5min。

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ(此步可选做)。

5、步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅱ酶活性测定。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至605nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液的配制:临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂4℃可保存一周;

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、25μL试剂六和200μL工作液,立即混匀,记录605nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。

 

复合体Ⅱ活力单位的计算:

a。使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T

=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)

÷T=113×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.226×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2.35×10 -4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2。1×104 L/ mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0。01 mL;V 样总:加入提取液体积,0。202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

b.使用96孔板测定的计算公式如下:

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T

=1118×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=226×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.452×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2.35×10 -4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×10 4 L/ mol /cm;d:96 孔板光径,0。5cm;V 样:加入样本体积,0。01 mL;V 样总:加入提取液体积,0。202mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

 

 

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