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酶联免疫测定(ELISA)标准化中存在的问题
发布时间:2013-11-28 点击次数:924次

酶联免疫测定(ELISA)标准化中存在的问题

 

免疫测定标准化的难点在于蛋白的不均一性、基质效应、交叉反应以及需要测定接近测定方法下限的浓度等,所测定的免疫反应性通常是在糖基化、降解和复合形式上有差异的蛋白同种型的混合体。

基质效应

免疫测定的基质效应通常定义为干扰抗原和抗体间反应但与分析物本身无关的非特异

因素。基质效应与测定模式和抗体选择有较大关系,因此,其对不同免疫测定的影响方式也有所不同。基质效应通常由蛋白、盐、磷脂、补体、抗免疫球蛋白抗体(类风湿因子和人抗鼠抗体)、药物和可能污染样本的物质引起。这些效应可通过仔细的实验设计来减少,例如使用一定亚型的高亲和力抗体或抗体片段、降低样本对总测定体积的比例、在测定缓冲液中加入免疫球蛋白、理想的温育温度和较长的温育时间。免疫测定的校准物通常用类似于样本的基质的缓冲液制备,基质可为无分析物的人血清、无免疫学交叉反应抗原的动物血清或蛋白含量类似于样本的人工缓冲液等。因为血清的成分各有不同,每批血清基质的差异有可能会影响校准,因此以纯蛋白溶液作为基质较容易保持一致,但对于结合至血清蛋白的激索来说,除了人血清外,其他基质不能使用。

血清和血浆中总蛋白和盐的浓度相当稳定,但尿液中盐浓度则变化较大,盐浓度增加对抗原抗体间反应起一个抑制作用。如果样本体积小于总反应体积的10%~15%,则蛋白的影响不明显,但有时为提高测定的敏感性,常需一个较大的样本体积。因此,要求参考方法具有低的测定下限,且样本体积对总反应体积应小至足以排除大部分基质效应。

样本中的免疫球蛋白可通过与测定中所使用的特异抗体发生反应而影响测定结果。如自身免疫病患者常有可与抗体反应的类风湿因子(RF)针对动物免疫球蛋白的嗜异性天然抗体相当普遍,但一般情况下其浓度和亲和力较低。自身抗体和嗜异性天然抗体的存在通常会引起假阳性反应。这些干扰可通过加入足量的来自同一种系的免疫球蛋白而减小,也可在测定中使用抗体的Fab(Fab)2片段替代完整抗体来减小干扰,但如果样本含有针对试剂抗体的个体基因型(idiotype)抗体,则这种方法无效。这种情况下只有将免疫球蛋白从样本中去除或使用一个依据另一个抗体的方法测定。

各种补体成分均能与抗体反应,从而干扰试剂抗体结合抗原及与次级抗体反应的能力,在双夹心测定中可引起假阳性,在竞争抑制试验中引起假阳性。小鼠IgG2,IgG2,免疫球蛋白亚对补体的效应尤为敏感。可通过加热样本或在反应缓冲液中加入螯合剂来排除补体的干扰,但加热会影响很多的分析物,而螯合剂对诸如锗螯合剂和酶等非放射性核索标记物有干扰,因此倾向于使用对补体效应不敏感的抗体或抗体片段建立测定方法。

有报道称磷脂在类固醇测定中可干扰抗原的结合而引起结果的假增高,许多其他因子如血清分离胶中的成分、抗凝剂去垢剂、药物、非酯化脂肪酸等对某些免疫测定也有干扰。

抗原的不均一性和交叉反应性

蛋白激索显然是不均一的,其在血液循环中除了有生物学活性形式外,还有前激索、片段和亚单位。富甲状腺索(PTH)、ACTH及其前体、催乳索和促胃液索的大的形式以及生长激索的拼接变异体等均可引起测定问题。使用单克隆抗体的两位点双夹心测定大大改善测定的特异性,例如使用抗绒毛膜促性腺激索的。和P亚单位的单抗建立的双夹心方法将不会测定游离的亚单位。使用针对ACTHPTH的氨基和羧基末端部分的两个抗体建立的双夹心方法则不会测定无生物学活性的片段。一般情况下,所希望测定的是具有生物学活性的成分,但有时为了某些特定的临床目的,则需要有特异的试验来测定降解产物,如hCG的核心成分。因此,为保证测定的特异性,就不仅要求有具有生物学活性的激索标准晶,而且要有临床上相关的降解产物的标准品。

某些血清蛋白有在等电点上不同(如。1―抗胰蛋白酶)或聚合程度不同如触珠蛋白的各种遗传变异体,尽管这些变异体的比例不同会影响其免疫测定的结果,但这并不是血清蛋白免疫测定的突出问题。用于血浆蛋白测定的试验通常使用多克隆抗血清,多克隆抗体测定不了蛋白结构上的微小差异。相反,使用单克隆抗体则有可能测不到某些变异体,这是血清蛋白免疫测定上的一个普遍问题糖蛋白的不均一性主要在于糖基化尤其是唾液酸含量的差异,唾液酸含量上的差异进而引起蛋白等电点和电泳移动性的差异。抗体通常对这些差异不敏感,因此,糖的不均一性对免疫反应性影响很小。然而蛋白上的糖链可通过修饰或覆盖一个肽决定基而改变蛋白的免疫反应性。相反,黏蛋白的主要抗原决定基则由糖成分所组成。免疫测定实验设计上小的差异也会引起多态性抗原测定结果上较大的差异,黏蛋白抗原CA125,CA199CA153的测定可以很明确的证明这一点。例如,由不同组织产生的CA153含有不同数量的20个氨基酸的串联重复序列,而试验中测定抗原所用的单抗是用肿瘤细胞制备的,因而所测定的抗原是结构不太明确的大分子。尽管大多数试剂厂家均使用相同的标准品和抗体,但其相互之间的相关性很差,这很可能是由于在实验设计上的差异所致,因此每一种方法都应有各自的参考范围值。

实验设计

免疫测定的实验设计主要涉及到抗体或抗原的使用浓度、温育温度、温育时间、测定模式是采用竞争抑制或双夹心直接测定,以及双夹心测定是采用一步还是两步法等,其对测定的影响主要是试验的测定下限、特异性核简便性等。一般来说,较高的抗体或抗原反应浓度、较高的温育温度(如37~C而非室温下)、较长的温育时间可以改善免疫试验的测定下限,但这一切又只是相对的,还要从试剂的实际应用着想,进行合理的优化。双抗夹心酶免疫试剂由于其简单方便,又具有较好的测定下限和特异性,在大多数蛋白激索和肿瘤标志物的测定上,现已基本上取代了放免竞争抑制试验。双抗夹心测定模式以两步法进行(即临床样本与酶标抗体分两步加入),可避免许多用一步法时可能会出现的问题,如与标记抗体可能发生交叉反应但与固相捕获抗体无交叉反应的物质可在*步温育后的洗涤步骤中去除;又如一步法常出现的“钩状”效应(即抗原浓度很高时反应显色反而很浅,表现为测假阳性)使用两步法就可以避免。但由于两步法所需测定时间相对要长一些,因此目前在临床实验中使用较多的是一步法。此外,当所测物质分子大小不一致时,大分子的反应通常较小分子要慢,如温育时间短,也会造成测定偏差。例如,在测定复合的前列腺特异抗原(PSA)(Mr90Kd)时,如使用较短的温育时间,与游离PSA相比,其结果将偏低。

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