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酶聯免疫測定(ELISA)標準化中存在的問題
發布時間:2013-11-28 點擊次數:994次

酶聯免疫測定(ELISA)標準化中存在的問題

 

免疫測定標準化的難點在于蛋白的不均一性、基質效應、交叉反應以及需要測定接近測定方法下限的濃度等,所測定的免疫反應性通常是在糖基化、降解和復合形式上有差異的蛋白同種型的混合體。

基質效應

免疫測定的基質效應通常定義為干擾抗原和抗體間反應但與分析物本身無關的非特異

因素。基質效應與測定模式和抗體選擇有較大關系,因此,其對不同免疫測定的影響方式也有所不同。基質效應通常由蛋白、鹽、磷脂、補體、抗免疫球蛋白抗體(類風濕因子和人抗鼠抗體)、藥物和可能污染樣本的物質引起。這些效應可通過仔細的實驗設計來減少,例如使用一定亞型的高親和力抗體或抗體片段、降低樣本對總測定體積的比例、在測定緩沖液中加入免疫球蛋白、理想的溫育溫度和較長的溫育時間。免疫測定的校準物通常用類似于樣本的基質的緩沖液制備,基質可為無分析物的人血清、無免疫學交叉反應抗原的動物血清或蛋白含量類似于樣本的人工緩沖液等。因為血清的成分各有不同,每批血清基質的差異有可能會影響校準,因此以純蛋白溶液作為基質較容易保持一致,但對于結合至血清蛋白的激索來說,除了人血清外,其他基質不能使用。

血清和血漿中總蛋白和鹽的濃度相當穩定,但尿液中鹽濃度則變化較大,鹽濃度增加對抗原抗體間反應起一個抑制作用。如果樣本體積小于總反應體積的10%~15%,則蛋白的影響不明顯,但有時為提高測定的敏感性,常需一個較大的樣本體積。因此,要求參考方法具有低的測定下限,且樣本體積對總反應體積應小至足以排除大部分基質效應。

樣本中的免疫球蛋白可通過與測定中所使用的特異抗體發生反應而影響測定結果。如自身免疫病患者常有可與抗體反應的類風濕因子(RF)針對動物免疫球蛋白的嗜異性天然抗體相當普遍,但一般情況下其濃度和親和力較低。自身抗體和嗜異性天然抗體的存在通常會引起假陽性反應。這些干擾可通過加入足量的來自同一種系的免疫球蛋白而減小,也可在測定中使用抗體的Fab(Fab)2片段替代完整抗體來減小干擾,但如果樣本含有針對試劑抗體的個體基因型(idiotype)抗體,則這種方法無效。這種情況下只有將免疫球蛋白從樣本中去除或使用一個依據另一個抗體的方法測定。

各種補體成分均能與抗體反應,從而干擾試劑抗體結合抗原及與次級抗體反應的能力,在雙夾心測定中可引起假陽性,在競爭抑制試驗中引起假陽性。小鼠IgG2,IgG2,免疫球蛋白亞對補體的效應尤為敏感。可通過加熱樣本或在反應緩沖液中加入螯合劑來排除補體的干擾,但加熱會影響很多的分析物,而螯合劑對諸如鍺螯合劑和酶等非放射性核索標記物有干擾,因此傾向于使用對補體效應不敏感的抗體或抗體片段建立測定方法。

有報道稱磷脂在類固醇測定中可干擾抗原的結合而引起結果的假增高,許多其他因子如血清分離膠中的成分、抗凝劑去垢劑、藥物、非酯化脂肪酸等對某些免疫測定也有干擾。

抗原的不均一性和交叉反應性

蛋白激索顯然是不均一的,其在血液循環中除了有生物學活性形式外,還有前激索、片段和亞單位。富甲狀腺索(PTH)、ACTH及其前體、催乳索和促胃液索的大的形式以及生長激索的拼接變異體等均可引起測定問題。使用單克隆抗體的兩位點雙夾心測定大大改善測定的特異性,例如使用抗絨毛膜促性腺激索的。和P亞單位的單抗建立的雙夾心方法將不會測定游離的亞單位。使用針對ACTHPTH的氨基和羧基末端部分的兩個抗體建立的雙夾心方法則不會測定無生物學活性的片段。一般情況下,所希望測定的是具有生物學活性的成分,但有時為了某些特定的臨床目的,則需要有特異的試驗來測定降解產物,如hCG的核心成分。因此,為保證測定的特異性,就不僅要求有具有生物學活性的激索標準晶,而且要有臨床上相關的降解產物的標準品。

某些血清蛋白有在等電點上不同(如。1―抗胰蛋白酶)或聚合程度不同如觸珠蛋白的各種遺傳變異體,盡管這些變異體的比例不同會影響其免疫測定的結果,但這并不是血清蛋白免疫測定的突出問題。用于血漿蛋白測定的試驗通常使用多克隆抗血清,多克隆抗體測定不了蛋白結構上的微小差異。相反,使用單克隆抗體則有可能測不到某些變異體,這是血清蛋白免疫測定上的一個普遍問題糖蛋白的不均一性主要在于糖基化尤其是唾液酸含量的差異,唾液酸含量上的差異進而引起蛋白等電點和電泳移動性的差異。抗體通常對這些差異不敏感,因此,糖的不均一性對免疫反應性影響很小。然而蛋白上的糖鏈可通過修飾或覆蓋一個肽決定基而改變蛋白的免疫反應性。相反,黏蛋白的主要抗原決定基則由糖成分所組成。免疫測定實驗設計上小的差異也會引起多態性抗原測定結果上較大的差異,黏蛋白抗原CA125,CA199CA153的測定可以很明確的證明這一點。例如,由不同組織產生的CA153含有不同數量的20個氨基酸的串聯重復序列,而試驗中測定抗原所用的單抗是用腫瘤細胞制備的,因而所測定的抗原是結構不太明確的大分子。盡管大多數試劑廠家均使用相同的標準品和抗體,但其相互之間的相關性很差,這很可能是由于在實驗設計上的差異所致,因此每一種方法都應有各自的參考范圍值。

實驗設計

免疫測定的實驗設計主要涉及到抗體或抗原的使用濃度、溫育溫度、溫育時間、測定模式是采用競爭抑制或雙夾心直接測定,以及雙夾心測定是采用一步還是兩步法等,其對測定的影響主要是試驗的測定下限、特異性核簡便性等。一般來說,較高的抗體或抗原反應濃度、較高的溫育溫度(如37~C而非室溫下)、較長的溫育時間可以改善免疫試驗的測定下限,但這一切又只是相對的,還要從試劑的實際應用著想,進行合理的優化。雙抗夾心酶免疫試劑由于其簡單方便,又具有較好的測定下限和特異性,在大多數蛋白激索和腫瘤標志物的測定上,現已基本上取代了放免競爭抑制試驗。雙抗夾心測定模式以兩步法進行(即臨床樣本與酶標抗體分兩步加入),可避免許多用一步法時可能會出現的問題,如與標記抗體可能發生交叉反應但與固相捕獲抗體無交叉反應的物質可在*步溫育后的洗滌步驟中去除;又如一步法常出現的“鉤狀”效應(即抗原濃度很高時反應顯色反而很淺,表現為測假陽性)使用兩步法就可以避免。但由于兩步法所需測定時間相對要長一些,因此目前在臨床實驗中使用較多的是一步法。此外,當所測物質分子大小不一致時,大分子的反應通常較小分子要慢,如溫育時間短,也會造成測定偏差。例如,在測定復合的前列腺特異抗原(PSA)(Mr90Kd)時,如使用較短的溫育時間,與游離PSA相比,其結果將偏低。

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