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還原糖含量試劑盒說明書
點擊次數:29 發布時間:2019-12-09

還原糖含量試劑盒說明書

可見分光光度法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

還原糖廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中。植物體內的還原糖主要包括葡萄糖、果糖和麥芽糖等,是zui常見的單糖和雙糖,其中葡萄糖和果糖不僅是呼吸作用的主要底物,也是進一步合成蔗糖、淀粉和纖維素的底物。

測定原理:

加熱促進堿性溶液中 3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖生成棕紅色氨基化合物,在540nm 有特征吸收峰;在一定的濃度范圍內,還原糖含量與540nm吸光度成線性關系,根據標準曲線,即可求出樣品中還原糖的量。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、蒸餾水。

試劑的組成和配制:

試劑一:100mL×1 瓶,4℃保存;

試劑二:20mL×1 瓶 ,4℃保存;

樣品中還原糖的提取:

1、細菌或細胞的處理:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議1000萬細菌或細胞加入2mL試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3S,間隔10S,重復30次),轉移到有蓋離心管中(防止加熱時水分散失),80℃水浴中40min 并且振蕩8~10 次,8000g,25℃離心 10min,取上清供測定用。

2、組織的處理:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.2g

組織,加入2mL試劑一),冰浴勻漿,轉移到有蓋離心管中(防止加熱時水分散失),80℃水浴中40min 并且振蕩8~10次,8000g,25℃離心10min,取上清供測定用。

3、血清(漿)的處理:按照血清(漿)體積(mL):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建

議取0.2mL血清(漿)加入2mL試劑一),冰浴勻漿,轉移到有蓋離心管中(防止加熱時水分散失),80℃水浴中 40min 并且振蕩 8~10 次,8000g,25℃離心10min,取上清供測定用。

測定步驟:

1、 分光光度計預熱 30min 以上,調節波長至 540nm,蒸餾水調零。

2、 調節水浴鍋至 95℃。

3、 在 EP 管中加入下列試劑:

試劑(μL)

對照管

測定管

樣本

700

700

試劑二

 

500

蒸餾水

500

 

 

將各管搖勻,在 95℃水浴中加熱 5min(蓋緊,防止水分散失),取出后立即冷卻至室溫,

混勻。在 540nm波長下讀取對照管和測定管吸光值。計算 ΔA=A 測定-A 對照。

注意:1、每個測定管需設一個對照管。

2、如果 ΔA大于2,需要將樣本用試劑一稀釋,計算公式中乘以相應稀釋倍數。

還原糖含量計算:

1、標準條件下測定回歸方程為y =8.5067x-2.0807;x為標準品濃度(mg/mL),y為吸光值。

2、按樣本鮮重計算:

還原糖 (μg/g 鮮重 )=[1000×(ΔA+2.0807)÷8.5067×V1]÷(W×V1÷V2)

=235×(ΔA +2.0807)÷W

3、按樣本蛋白濃度計算:

還原糖(μg/mg prot)=[1000×(ΔA+2.0807)÷8.5067×V1]÷(V1×Cpr)

=117.55 ×(ΔA+2.0807)÷Cpr

4、按細菌或細胞密度計算:

還原糖(μg/104cell)=[1000×(ΔA+2.0807)÷8.5067×V1]÷(1000×V1÷V2)

=0.235×(ΔA+2.0807)

5、按血清(漿)體積計算:

還原糖(μg/mL)=[1000×(ΔA+2.0807) ÷8.5067×V1]÷(V3×V1÷V2)

=1175.5×(ΔA+2.0807)

1000:1mg/mL=1000µg/mL;V1:加入樣本體積,0.7mL;V2:加入提取液體積,2 mL;V3:加入血清(漿體積),0.2mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;1000:細菌或細胞總數,1000 萬。

注意:最低檢測限為 1mg/g  鮮重或 10μg/mg prot

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