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AxyPrep无内毒素质粒大量试剂盒
点击次数:46 发布时间:2019-10-23

 

AxyPrep无内毒素质粒大量试剂盒

 

本试剂盒采用 SDS 碱裂解法,结合 DNA 制备膜选择性吸附 DNA。同时采用特殊溶液(Buffer ETR 和 Buffer PF)有效去除内毒素,可从 80-200 ml 细菌培养物中提取出多至 500 高纯度质粒 DNA,其内毒素水平控制在 0。1 EU/ 以下。

 

一、 试剂盒组成、贮存、稳定性

 

 

Cat。 No。

AP-MX-EP-2

AP-MX-EP-10

AP-MX-EP-25

 

制备次数

2 preps

10 preps

25 preps

 

制备管(Maxiprep column

 

2

 

10

 

25

 

大量滤器(Maxiprep syringe filter

 

2

 

10

 

25

 

RNase A

48 µl

270 µl

700 µl

 

Buffer S1

24

ml

115

ml

285

ml

 

Buffer S2

24

ml

115

ml

285

ml

 

Buffer S3K

24

ml

115

ml

285

ml

 

Buffer B

24

ml

115

ml

285

ml

 

Buffer W1

3

ml

160

ml

350

ml

 

Buffer W2 concentrate

15

ml

66

ml

150

ml

 

ET-free water (70% Ethanol)

1.8

ml

7.5

ml

18

ml

 

Eluent A

8

ml

30

ml

70

ml

 

Buffer ETR

10

ml

50

ml

120

ml

 

Buffer PF

3

ml

13

ml

30

ml

 

说明书

 

1

 

1

 

1

 

 

RNase A50 mg/ml,室温可贮存 6 个月,长期贮存于-20℃。

 

Buffer S1:细菌悬浮液。加入 RNase A 后,混合均匀,4℃贮存。

 

Buffer S2:细菌裂解液(含 SDS/NaOH),室温密闭贮存。

 

Buffer S3K:中和液,室温密闭贮存。

 

Buffer BDNA 结合溶液,室温密闭贮存。

 

Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。

 

Buffer W2 concentrate:去盐液。使用前,按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇(可用无水乙醇或 95%乙醇)。混合均匀,室温密闭贮存。

 

ET-free water (70% Ethanol):使用前,按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇(可用无水乙醇或 95%乙醇)。混合均匀,室温密闭贮存。

 

Eluent A:洗脱液。室温密闭贮存。

 

Buffer ETR:内毒素去除液。室温密闭贮存。

 

Buffer PF:分相缓冲液。室温密闭贮存。

 

 

Page 1

 

二、 注意事项

 

  • 细菌过量将影响细菌裂解、质粒 DNA 的释放,导致内毒素含量过高。

 

  • 步骤 3 和步骤 4 的操作必须温和。剧烈摇晃将导致基因组 DNA 的污染。但混合必须充分,否则影响得率。

 

  • 在加入 Buffer S3K 时,蛋白质和基因组 DNA 形成粘稠的白色絮状沉淀,必须充分混合均匀,使凝集块中间也得到充分中和凝结。

 

  • Buffer S2Buffer S3KBuffer B  Buffer W1 含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和防护眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣物,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。

三、 实验准备

 

  • 第一次使用前,RNase A 全部加入 Buffer S1 中,4℃贮存。

 

  • 第一次使用前,Buffer W2 concentrate 中加入指定体积的无水乙醇。

 

  • 第一次使用前,ET-free water (70% Ethanol)中加入指定体积的无水乙醇。使用前置于-20℃预冷。

 

  • 使用前,检查 Buffer S2 是否出现沉淀,如出现沉淀,应于 37℃温浴加热溶解并冷却至室温后使用。

 

  • Eluent A  65℃预热后使用,有利于提高质粒得率。

 

  • Buffer S3KBuffer B  Buffer ETR 使用前置于 4℃预冷。

 

  • 准备无核酸和核酸酶污染的 Tip 头、50ml 离心管。

 

  • 水平离心机(转速可达到 4,000×g)及冷冻离心机(转速可达到 8,000×g

 

  • 准备 56℃水浴。

四、 操作步骤

 

80-200 ml 在 LB 培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基,菌液体积应减半或更少),3,000 ×g 离心 8 min,弃上清。将离心管倒置于纸巾上 1 min,除尽上清。

  • 一般过夜培养的菌液 OD600 在 2。0-4。0 之间。若菌液 OD600 >4,菌量需减少。

10 ml Buffer S1,悬浮细菌沉淀,悬浮需均匀,不应留有小的菌块。

确认 Buffer S1 中已加入 RNase A。

10 ml Buffer S2,温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过 5 min

  • Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖,以免空气中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH,降低溶菌效率。

避免剧烈摇晃,否则将导致基因组 DNA 污染。

此步骤不宜超过 5 min

 

  • 10 ml 4℃预冷的 Buffer S3K,温和并充分地上下翻转混合,直至溶液颜色均一并形成紧实的凝集块,室温放置 5 min。
    • 加入 Buffer S3K 后应立即混合,以避免形成局部的凝结块。

 

  • 避免剧烈摇晃,否则将导致基因组 DNA 污染。

 

5.10 ml 4℃预冷的 Buffer B,温和并充分地上下翻转混合 10 次,8,000×g 离心(4℃)10 min

 

 

步骤 6-9 可以选择离心法或负压法。

 

  • 离心法:

 

6A. 先将大量制备管放入 50 ml 离心管中。吸取步骤 5 中的混合液,转移到大量滤器Maxiprep syringe filter中。

 

7A. 插入推杆,垂直向下缓慢将滤液推注至大量制备管中,6,000×g 离心 5 min。

 8A. 弃滤液,加 12 ml Buffer W1 至制备管中,6,000×g 离心 5 min

9A. 弃滤液,加 14 ml Buffer W2 至制备管中,6,000×g 离心 5 min

 

  • 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
  • 负压法:

 

6B. 正确连接负压装置,将大量制备管插到负压装置的插口上。

7B。 吸取步骤 5 中的上清液,转移到大量滤器中,插入推杆,垂直向下缓慢将滤液推注至大量制备管中,开启并调节负压至-25 ~ -30 英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液。

8B。 保持负压,加 12 ml Buffer W1,吸尽管中溶液。

9B. 保持负压,加 14 ml Buffer W2,吸尽管中溶液。

确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。

再在大量制备管中加 4 ml Buffer W26,000×g 离心 5 min

将制备管置于另一洁净 50 ml 离心管中,在制备管膜中央加 2 ml Eluent A,室温静置 5 min6,000×g 离心 5 min 收集质粒 DNA

Eluent A 加热至 65℃将提高洗脱效率。

弃制备管。在滤液中加入 4 ml 预冷的 Buffer ETR,混合均匀。

如果 Buffer ETR 浑浊,于冰上静置,直至溶液变得清亮;如果分层,则混合均匀。

加入 1 ml Buffer PF,混合均匀。

*溶液可能会出现微弱的浑浊现象,此为正常现象。

置于 56°C 孵育 8 min。室温 4,000×g 离心 5 min

孵育后溶液将出现大量乳白色沉淀,否则延长孵育时间。

孵育后溶液有可能出现分层现象,此为正常现象。

此步骤的离心必须使用吊篮式(swing-out rotor)离心机或其他水平离心机

 

取无色上相至 50 ml 离心管中,加入 0。8 倍体积异丙醇(如:取得 6 ml 无色上相,则加入 4.8 ml 异丙醇),混合均匀。室温静置 10 min。8,000×g 离心 10 min尽可能弃尽上清。加入 2 ml 预冷的 ET-free water70% Ethanol,洗涤沉淀,8,000×g 离心 5 min

ET-free water70% Ethanol)使用前确定已加入指定体积的无水乙醇。

尽可能弃尽上清。在超净台中干燥 10-15 min

管壁上残留液体可短暂离心后吸弃。

加入 500  Eluent A 或无内毒素水溶解质粒 DNA

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