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葡萄糖含量试剂盒说明书(测组织、细菌或细胞) 微量法
点击次数:26 发布时间:2019-10-23

                                                           规格:100管/96样

葡萄糖含量试剂盒说明书(测组织、细菌或细胞)

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

葡萄糖不仅是细胞能量代谢的主要底物,而且其代谢中间产物是生物合成的重要底物。植物可通过光合作用产生葡萄糖。就哺乳动物而言,葡萄糖不仅是大脑神经系统、肌肉、脂肪组

织等的唯yi能源,而且与还原性辅酶、乳糖和乳脂的合成密切相关。

测定原理:

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并产生过氧化氢;过氧化物酶催化过氧化氢氧化4-氨基安替比林偶联酚,生成有色化合物,在 505 nm 有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵和蒸馏水

试剂的组成和配制:

试剂一:0。5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:液体 10ml×1 瓶,4℃保存;

试剂三:液体 10ml×1 瓶,4℃保存;

葡萄糖提取:

1、组织的处理:按照组织质量(g):蒸馏水体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0。1g组织,加入1mL蒸馏水),研磨成匀浆,95℃水浴10分钟(盖紧,防止水分散失),冷却后,8000g,25℃离心10min,取上清液备用。

2、细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):蒸馏水体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL蒸馏水),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3S,间隔10S,重复30次),95℃水浴10分钟(盖紧,防止水分散失),冷却后,8000g,25℃离心 10min,取上清液备用。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至505nm,蒸馏水调零。

2、混合试剂的配制:使用前将试剂二和试剂三1:1等体积混合,用多少配多少。

3、加样表(在EP管或96孔板中加入下列试剂):

试剂(μL)

空白管

标准管

测定管

样本

 

 

20

试剂一

 

20

 

蒸馏水

20

 

 

混合试剂

180

180

180

混匀,置 37℃(哺乳动物)或 25'C(其它物种)保温 15min 后,于 505nm 波长处读取吸光

度。空白管、标准管和测定管吸光值分别记为 A1、A2 和 A3。空白管和标准管只要做一管。

葡萄糖含量计算:

1、按样本蛋白浓度计算

葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 标准×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)

=0。5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷Cpr。

2、按样本鲜重计算

葡萄糖含量(µmol/g 鲜重)= (C 标准×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)

=0.5×(A3-A1)÷(A2-A1)÷W

3、按细菌或细胞密度计算

葡萄糖含量(µmol/104cell)= (C 标准×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)

=0。001×(A3-A1)÷(A2-A1)

C 标准:标准管浓度,0.5µmol/mL;V1:加入样本体积,0.1mL;V2:加入提取液体积,1mL;

Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

注意:最低检测限为 50nmol/g  鲜重或 0。5nmol/mg prot

 

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