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酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术原理
点击次数:105 发布时间:2019-05-01

 

酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术

 

 

  • 酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术的原理

由于醋酸纤维膜是由醋酸纤维素组成的,对蛋白质分子的移动几乎无阻力,差不多所有在电场中能泳动的物质均能在醋酸纤维膜里自由移动,因此在免疫电泳中,醋酸纤维膜是一优良的载体。将酶标记抗体与相应抗原在醋酸纤维膜进行电泳,生成免疫复合物,用酶底物显色,能大幅度地提高检测的灵敏度和可靠性。使用酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术(Enzyme-Linked-Cellulosa-Acetate-membrane-Immunoelectropheresis,简称ELCAIE),笔者文章公布的检出量是0.3ng的RMV,其实当时的实验结果已经显示0.1ng的RMV检测量。

  • 酶标醋酸纤维膜免疫电泳技术的程序(检测RMV)

1,器材与设备

(1)电泳仪(包括电泳槽);

(2)醋酸纤维膜(10cm×14cm,厚度10dmm;

(3)微量进样器;

(4)竹钳。

2,材料与试剂

  1. 以0。2mol/LpH7。2硼酸缓冲液连续稀释的RMV溶液(10ng/ml→1×10⒌ng/ml
  2. HRP标记的RMV免疫的兔IgG(戊二醛一步法交联);
  3. 洗涤液,每1000ml中有500ml 0.1mol pH8.2巴比妥缓冲液和85g食盐,其余为蒸馏水;
  4. 底物与供氢体溶液(H2O2和DAB-4HC1
  5. 0。1mol/L pH8。6巴比妥钠盐酸缓冲液。

 3,实验程序

  1. 将醋酸纤维膜用软铅笔轻轻划好点样线,酶标抗体样点距膜边3cm,抗原样点与酶标抗体样点对距3cm,两个样点横距1.5cm.
  2. 将上述薄膜浸入0.1mol/L pH8.6巴比妥钠盐酸缓冲液中浸湿,取出薄膜,用滤纸吸去表面水分,但不要干燥。
  3. 用微量进样器点样,抗体每样点用酶标抗体液10ul,抗原样点第一点是对照,滴加10ul健青菜蛋白溶液;第二、三、四、五样点滴加RMV抗原溶液各10ul,浓度分别为1×10⒌ng/ml、1×10⒋ng/ml、1×10⒊ng/ml、100ng/ml;第六、七样点分别滴加5ul、3ul、,浓度为100ng/ml;第八样点滴加10ul,浓度为10ng/ml;第九样点滴加5ul,浓度为10ng/ml。
  4. 点样完毕,将薄膜置于电泳槽中央棱边,使其架空,然后用滤纸作盐桥,电泳缓冲液为0。1mol/L PH8。6巴比妥钠盐酸缓冲液,抗原端接负极。
  5. 待作为盐桥的滤纸全部湿润后,接通电源,控制电压150V,电泳时间1。5h左右。
  6. 电泳完毕,将薄膜浸洗在洗涤中过一夜。
  7. 次日将薄膜在清水中漂洗3-5min后取出。
  8. 最后滴加H2O2(0。3%)和DAB-4HC1溶液,各占一半量,几分钟内就会显示结果。
  9. 声明:巴比妥,文字中含违禁字请无视‘那’字

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