山东11选5走势图

當前位置:
首頁 > 技術文章 > 線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書
目錄導航 Directory
服務熱線
技術支持Article
線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書
點擊次數:196 發布時間:2019-04-18

貨號YJ1219                                                規格:100管/48樣

線粒體復合體Ⅴ試劑盒說明書

微量法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

線粒體復合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體中,由F1和F0兩個亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產生的質子電化學梯度催化ATP合成,也可逆過程水解ATP。此外,復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關鍵酶。

測定原理:

復合體Ⅴ水解ATP產生ADP和Pi,通過測定Pi增加速率來測定復合體Ⅴ活性。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

試劑一:100mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:80mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑三:2mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑四:粉劑×1 支,-20℃保存;臨用前加入2mL蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五:8mL×1 瓶,4℃保存;

試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入4mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑九:液體 10mL×1 瓶,室溫保存。

定磷試劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑應為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染(請根據需要,用多少配多少)。

注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

① 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿 600g,4℃離心 5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。

④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅴ(此步可選

做)。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入800uL試劑二和8uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于復合體Ⅴ酶活性測定。

測定步驟:

  1. 酶促反應(在EP管中加入下列試劑)

試劑名稱(μL)

對照管

測定管

試劑四

20

20

試劑五

80

80

樣本

 

100

混勻, 37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)準確水浴 30min

試劑六

40

40

樣本

100

 

混勻,4000g,25℃離心 10min,取上清液

  1. 定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑)

上清液

30

30

定磷試劑

170

170

混勻,室溫靜置10min后,在660nm處讀取A測定管和A對照管,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設一個對照管。

復合體Ⅴ活性計算:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

標準條件下測定的回歸方程為y= 1.2487x + 0.0361;x為標準品濃度(mmol/L),y為A 值。

1、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

(1)按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

(2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min /g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)

V 反總:反應體系總體積,2.4×10-4 L; V 樣:加入樣本體積,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬。

b.使用96孔板測定的計算公式如下:

標準條件下測定的回歸方程為y=0.624x + 0.0361;x為標準品濃度(mmol/L),y 為A 值。

1、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

(1)按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

(2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘產生1nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=103.4× (ΔA-0.0361) ÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1 nmol無機磷定義為一個酶活性單位。

復合體Ⅴ活性(nmol/min /104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.206× (ΔA-0.0361)

V 反總:反應體系總體積,2.4×10-4 L;V 樣:加入樣本體積,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬。

 

聯系人
在線客服
用心服務成就您我
上海快3 上海快3 大河彩票APP 幸运赛车官网 广东11选5 七星彩票网 广东11选5 广东11选5